近期，我校生物工程学院王小元教授团队胡晓清课题组在毕赤酵母底盘细胞设计改造方面取得重要进展，研究成果“Impact of cell wall polysaccharide modifications on the performance of Pichia pastoris: novel mutants with enhanced fitness and functionality for bioproduction applications”正式发表于Microbial Cell Factories (IF = 6.4) (https://doi.org/10.1186/s12934-024-02333-0)。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是广泛用于蛋白表达和代谢物催化合成的重要工业宿主菌之一，目前已被用作生产各种生化产品，如重组蛋白产品（抗体、疫苗、食品和饲料酶等）以及高价值产物（化妆品原料、生物燃料和其他化学品）。毕赤酵母外源表达系统的优势包括：（1）具有高效的有氧呼吸模式并实现高密度培养，可以在含有甲醇、葡萄糖、甘油或乙醇作为唯一碳源的廉价介质上快速生长，在充足碳氮源、供氧和搅拌情况下OD600可达到800以上；（2）作为真核生物，具备大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等原核表达系统所不具备的蛋白翻译后修饰能力，如糖基化、肽链折叠、二硫键的形成等，非常适合人源或真核来源基因的表达；（3）具有严谨调控的启动子且遗传操作工具日臻完善，例如高效的DNA转化能力且基因编辑工具较多；（4）具备高效的分泌系统，可促进蛋白质有效的向外分泌，对于蛋白质的分离纯化优势明显。
基于可持续生物制造的诉求，利用底盘工程设计策略来提高毕赤酵母宿主性能已成为研究焦点。如Weinhandl等人对Cwp1、Scw10和Och1失活，从而增加支链氨基酸转移酶的分泌，提高糖基化蛋白质水平，改造后的细胞壁粘度降低，结构更具渗透性。Näätsaari等人通过删除KU70同源物（一种对NHEJ至关重要的DNA末端结合蛋白），显著提高同源重组效率达90%以上。但目前尚无针对底盘细胞细胞壁的修饰改造。酵母细胞壁主要是由多聚糖组成（葡聚糖和甘露聚糖），其约占细胞壁干重的85%-90%，这些多聚糖一方面消耗了大量碳源，降低了碳源对产物的转化率，另外一方面，束缚了细胞尺寸，对细胞诸多特性产生了一定程度的限制。
胡晓清课题组基于对毕赤酵母全基因组非必需基因剖析和细胞膜壁结构表征，首次通过精简毕赤酵母细胞壁葡聚糖以提高其生长速率和生产性能。如图所示，前期研究中针对毕赤酵母细胞壁中β-1,3-D-葡聚糖合成相关基因进行了敲除，成功开发了两种底盘细胞H001（GS115-ΔPAS_chr-3_0225）和H002（GS115-ΔPAS_chr-3_0661）。相比于原始菌株GS115，改造后的底盘细胞H001和H002其生长速率加快；通过透射电镜观察发现，与原始菌株GS115相比，菌株H001和H002其细胞外壁结构变得更加疏松明亮，且细胞体积变大，这与葡聚糖含量减少相关。改造后的底盘细胞分别进行绿色荧光蛋白（GFP）和人类表皮生长因子（hegf）表达，以及腺苷甲硫氨酸（SAM）和麦角硫因（ERG）异源合成，发现无论是针对外源蛋白还是代谢产物，改造后的菌株生物合成效率相比于GS115均得到了提升。为深入探究其机理，分别从碳源利用率、ATP和NADPH含量、细胞壁脂质组成分等三个方面进行分析。发现菌株H001和H002相比于GS115碳源得率显著提升，且ATP和NADPH含量均得到一定改善。尤其是脂质组学分析揭示，H001和H002的多个不饱和脂肪酸增多，这与抗氧化胁迫能力提升相关。因此毕赤酵母H001和H002是性能更优的底盘细胞，目前已获专利授权。
图形摘要
胡晓清副教授为论文的通讯作者，我校2021级硕士生程冰洁为第一作者，余克洋、刘昭君和翁星为并列一作。上述研究得到了国家重点研发计划（2021YFC2100900）和广州悦荟化妆品有限公司项目资助。
近年来王小元教授团队以合成生物学和微生物细胞膜壁结构理论为指导，在系统开展微生物细胞工厂设计改造方面取得丰硕成果，相关研究成果已发表在Prog Lipid Res, J Biol Chem, Biotechnol Adv, Microb Cell Fact, Metab Eng等本领域权威期刊。
