近期，江南大学生物工程学院石贵阳教授团队在创新合成生物学调控方式相关研究中取得重要进展，成果“Design of a sorbitol-activated nitrogen metabolism-dependent regulatory system for redirection of carbon metabolism flow in Bacillus licheniformis ” 正式发表于Nucleic Acids Research（IF 14.9, https://doi.org/10.1093/nar/gkad859)。20级博士研究生何贺贺为文章第一作者。
对代谢通量进行人为调控已成为提高细胞工厂生产竞争力的常用策略，目前这主要是通过借助于相应目标通路对碳源代谢物的特定响应来实现的。但碳代谢物较长的分解代谢路径易导致普遍的迟滞效应。此外，基因组中广泛存在的响应碳代谢物的靶点，易造成全局代谢水平上的不必要扰动，正交性被严重削弱。面对以上问题，石贵阳团队另辟蹊径，设计了氮源代谢调控系统，并开发氮代谢信号通路关键节点的调控潜力，拓宽了当今代谢调控方式的应用。
团队首先深入分析了芽孢杆菌细胞工厂氮代谢的普遍机制，并围绕谷氨酰胺，谷氨酰胺合成酶（GS），转录因子GlnR, TnrA的互作机制，巧妙设计基因回路。开发出了以关键转录因子GlnR为核心，谷氨酰胺添加依赖型的初级氮代谢调控系统。并初步表征其对靶基因具有约10%的调控效率。随后，杂交启动子策略的引入使得GlnR特定的调控模块从复杂的遗传背景中被特定地抽离出来，避免了未知调控的串扰并实现了放大，调控系统的效率由此进一步提高到约28.0%。同时结果表明，用提高谷氨酰胺添加浓度的方式来提高氮代谢调控系统的效率难得达到预期（图 1）。
图 1 氮代谢调控系统的设计和优化
为了深入解析其中原因，作者对地衣芽孢杆菌胞内的谷氨酰胺pool进行分析。结果表明，芽孢杆菌对谷氨酰胺运输存在严谨的运输限制，胞内谷氨酰胺pool相对稳定的维持在约1.48 mM，并且受外部添加谷氨酰胺浓度的影响较小（图 2）。作者总结，谷氨酰胺添加依赖型的氮代谢调控系统调控效率较低的原因是胞内谷氨酰胺pool未能使谷氨酰胺合成酶GS（IC 50 = 2.4 mM）充分地转变为反馈抑制型谷氨酰胺合成酶（FBI-GS）状态，这造成GlnR由于受到自身C端结构域折叠的影响而呈现自我抑制状态。于是作者选择通过蛋白质工程技术策略，删除GlnR的C端结构域以恢复其DNA结合活性，巧妙避免了GlnR活性对FBI-GS的依赖。同时为了使其表达可控，在综合了对多种相关糖醇类诱导剂表征后，将截短的glnR基因置于可诱导的山梨醇启动子控制下。随后，将该表达盒引入调控系统。作者将此改造的氮代谢调控系统命名为SNTFRS，其可实现对靶基因调控效率的灵活控制，最高可达100%（图 3）。
图 2 胞内代谢物和谷氨酰胺转运水平分析
图 3 SNTFRS的设计和测试
在SNTFRS的测试中，作者选取了碳代谢溢流支路作为靶通路。最终实验结果表明，调控系统具有高效重定向碳代谢流的能力。同时也对厌氧条件下的性能进行了表征，论证了该系统的普适性。在这项工作中，作者提供了一个新颖的氮代谢调控系统，并揭示了其在合成生物学中具有的巨大潜力，这为日后合成生物学的多维度代谢调控的发展打下了坚实基础。
上述研究工作得到了国家重点研发计划（2020YF A0907700, 2018YF A0900504，2018YFA0900300），国家自然科学基金（31401674）等基金资助。近年来石贵阳教授团队在“地衣芽孢杆菌合成生物学研究”等方面取得一系列丰硕研究成果，相关研究成果已发表在Nucleic Acids Research, ACS Synthetic Biology, Journal of Agricultural and Food Chemistry等本领域权威期刊。
