近期，我校生物工程学院和未来食品科学中心陈坚院士团队周景文教授课题组在四氢嘧啶的高效制备方面取得重要进展，研究成果“Metabolic engineering combined with enzyme engineering for overproduction of ectoine in Escherichia coli”正式发表于Bioresource Technology (IF = 11.4) (https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.129862)。
四氢嘧啶（Ectoine）是L-天冬氨酸的环状氨基酸衍生物，作为保护剂和稳定剂，在细胞中对各种外部压力（例如高温、高渗透压、干燥和辐射）起着重要作用，广泛应用于化妆品和生物医药等领域。传统的“细菌泌乳法” 存在腐蚀发酵罐以及下游纯化导致环境污染等缺点。近年来，代谢改造与发酵优化工业微生物以实现四氢嘧啶异源合成的技术日趋成熟。
研究团队针对四氢嘧啶制备过程中葡萄糖转化率低和限速酶——二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶活性不够高的问题，采用代谢工程和酶工程结合的策略高效合成四氢嘧啶。由于大肠杆菌中缺少四氢嘧啶直接合成途径，研究人员将4种异源的四氢嘧啶合成途径引入大肠杆菌中，筛选出最适的出发菌株。比较发现在E. coli BL21(DE3)中表达来源维式盐单胞菌(Halomonas venusta ZH )的合成途径效果最佳，通过表达载体优化后，在摇瓶水平发酵可积累2.1 g/L的四氢嘧啶。然后通过过表达来源谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸激酶突变体(LysCT311I)与来源伸长盐单胞菌的天冬氨酸半醛脱氢酶(ASD)增加了前体供应。为进一步提高限速酶的活性，对EctB进行半理性设计，突变体(E407D)在摇瓶水平中可积累3.3 g/L四氢嘧啶，相比对照菌株提高了13.8%。分析不同EctB有效突变体和野生型与底物分子的对接模拟，发现所有点突变都位于蛋白质表面而非活性位点，这些突变可能通过表面电荷的变化增加了结构的灵活性。通过引入非氧化糖酵解途径（NOG途径）提高乙酰辅酶A的供应，四氢嘧啶产量进一步提升至4.1 g/L。最终，在5 L发酵罐中对工程菌株ECT9-5进行分批补料发酵，发酵过程控制底物葡萄糖浓度在1 g/L以内，发酵60 h后四氢嘧啶产量达到67.1 g/L，葡萄糖转化率为0.3 g/g。本研究通过半理性设计改造关键酶EctB提高了四氢嘧啶的生产能力，为工业化生产奠定了基础。另外，所采用的策略也可为高效生产其他天冬氨酸衍生物提供参考。
图形摘要
周景文教授课题组曾伟主助理研究员和吴志猛教授为论文的通讯作者，我校2021级硕士生李莉红为第一作者。上述研究得到了国家重点研发计划项目（2022YFC2106100）的资助。
近年来，周景文教授课题组以合成生物学科学理论为指导，在系统开展高效合成植物天然产物、维生素、食品功能蛋白等的细胞工厂构建及产业化方面取得丰硕成果，相关研究成果已发表在Advanced Materials、Nature Communications、Advanced Science、Metabolic Engineering、Bioresource Technology等本领域权威期刊。
