近期，我校生物工程学院周楠迪教授团队在胞内microRNA（miRNA）检测方面取得重要进展，研究成果“Nanosensor Based on the Dual-Entropy-Driven Modulation Strategy for Intracellular Detection of MicroRNA”正式发表于自然指数期刊Analytical Chemistry (IF 7.4) (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c03843)。
miRNA是一类非编码RNA，由组织特异性因子严格控制表达。miRNA表达的失调会导致癌症、心血管疾病和神经系统疾病等，因此miRNA被视为特异性生物标志物。目前已经报道了多种用于检测miRNA的生物传感器。然而，由于miRNA的丰度较低，辨别胞内浓度变化具备挑战性。熵驱动扩增技术无需额外酶反应，设计简便，被开发用于相关致病基因的检测研究。然而传统的熵驱动扩增策略的反应过程中涉及燃料链的额外添加以及大量序列的冗余，增加了溶液环境的干扰性，胞内检测方案的设计仍然面临挑战。
该研究报道了一种在金纳米粒子（AuNPs）表面构建的双熵驱动扩增系统，以实现miRNA-21的荧光测定和细胞内成像。双熵驱动的放大策略将燃料链内部化，以避免传统熵驱动放大策略中额外添加的复杂性。独特的自锁燃料链系统是通过将三链结构附着在两组AuNPs上而建立的，其中Cy5荧光标记首先被AuNPs猝灭。靶标miRNA-21被识别后，燃料链将自动解锁，并驱动循环反应，导致荧光恢复。自供电和回收燃料链大大提高了反应过程的自动化和智能化（图1）。
图1 （A）双熵驱动的DNA扩增系统构建原理图；（B）miRNA-21的细胞内检测；（C）双熵驱动DNA扩增策略的设计原理。
为了评估双熵驱动扩增系统的检测性能，测量了含有不同浓度miRNA-21的样品。检测系统的荧光强度随着目标浓度的增加而增加，在最佳条件下，纳米传感器的线性响应范围为5 pM至25 nM。当传感器用于miRNA-21的检测时获得显著区分于其他miRNA的荧光信号，表明该传感器具有较好的特异性。CLSM结果显示只有当双熵增系统整体被递送到含有miRNA-21的肿瘤细胞中时，靶标miRNA才能启动双熵驱动扩增系统。相同的检测体系在用于Hek-293细胞中miRNA-21的测定时仅观察到微弱的Cy5荧光信号，说明Hek-293细胞中存在极少量的miRNA-21（图2）。另外采用单熵增系统与两种细胞孵育时，仅观察到非常微弱的荧光信号，说明双熵驱动扩增系统的信号需要由AuNPs-ABC和AuNPs-DEF共同存在时释放，而单独AuNPs-ABC或AuNP-DEF在胞内维持稳定状态，即使有目标物的存在，由于燃料链的缺乏而无法释放相应的荧光信号，充分验证了双熵驱动扩增系统的原理。双熵驱动策略的提出为细胞内miRNA分析提供了一种集成而强大的方法，并在生物医学领域显示出较好的潜力。
图2 双熵驱动扩增系统的细胞内验证。蓝色：DAPI（激发：405 nm，发射：420-460 nm）和红色：Cy5（激发：650 nm，发射660-700 nm）。比例尺：50 μm。
上述研究工作中，江南大学21级博士后蔡蓉凤为论文第一作者，周楠迪教授为论文的通讯作者。研究工作得到了国家重点研发计划（2023YFF1105303）、国家自然科学基金（42177212, 62301234, 32371430）等资助。
近年来周楠迪教授团队在核酸适配体的筛选优化和应用、分子诊断技术、新型纳米生物传感器的研制、智能纳米器件的构建和应用、POCT产品研制、食品安全检测、发酵过程中代谢物监测等方面取得丰硕成果，相关成果发表在Biosensors and Bioelectronics、ACS Applied Materials & Interfaces、Sensors and Actuators B: Chemical、Food Chemistry、Journal Agricultural and Food Chemistry等本领域权威期刊。
