近期，我校生物工程学院穆晓清教授和聂尧教授团队在胺脱氢酶的底物特异性改造方面取得重要进展，研究成果“Shield Machine-like Substrate Walking Strategy-Based Pocket Engineering of F‑Amine Dehydrogenase for Accessing Structurally Diverse Fused-Ring and Linked-Ring Aryl Ketones” 以封面文章形式发表于ACS Catalysis (IF = 12.9) (https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c00068)。
具有双环结构的手性稠环和连环芳香胺是药物合成领域重要的结构砌块。胺脱氢酶催化的前手性酮底物的不对称还原胺化制备手性胺的反应途径具有原子利用率高、对映选择性高及副产物仅为水等优点，在手性胺合成中极具吸引力。然而，目前报道的胺脱氢酶数量少，前手性酮底物范围有限，无法催化结构多样的稠环和连环芳香酮底物的还原胺化。
底物行走是一种有效的共进化策略，可通过逐步诱变景观适应赋予酶催化特定目标底物的特异性。实施底物行走策略的关键是选择一种分子结构介于酶可催化的起始底物和目标底物之间的特定化合物作为过渡底物。鉴于稠环和连环酮底物的结构兼具多样性和复杂性，应用传统的底物行走策略进行目标稠环和连环酮底物的特异性改造可能需要大量的筛选工作。
为了提高进化成功率并减轻筛选工作量，研究人员在传统底物行走策略的基础上，设计了一种使用多过渡底物的盾构机式底物行走策略。该策略的原理是基于底物分子尺寸的匹配性，选择一组苯环位于底物侧链末端且碳骨架规则延伸的单环芳香酮同系物作为过渡底物，利用过渡底物分子结构中苯环位置的逐步延伸来创造底物结合空间，以满足结构多样的稠环和连环酮底物结合的空间需求。研究人员以源于栗褐芽孢杆菌（Bacillus badius）的胺脱氢酶为出发酶，基于盾构机式底物行走策略对其进行底物特异性进化。以所选过渡底物的活性提高和特异性拓展为多尺度的筛选指标，从库容量仅为58株定点突变体的突变文库中筛选出9株阳性突变体。在未进行额外突变实验下，9株阳性突变体显示出显著拓展的稠环和连环酮底物范围，并以高达94%的产率和>99% ee (R)或>99:1顺式/反式实现系列高附加值手性稠环和连环胺的生物胺化制备。此外，基于酶-底物复合物结构的特征分析提供了对拓展底物特异性来源的分子见解。本研究展示了一种简洁的工程流程，可用于结构多样的底物集合的底物特异性快速进化，在酶工程中具有潜在的应用前景。
图形摘要
论文封面
穆晓清教授和聂尧教授为论文的通讯作者，我校2020级博士生吴涛为第一作者。上述研究得到了国家重点研发计划（2021YFC2100100）的资助。
近年来穆晓清教授团队在高效辅酶依赖型氧化还原酶的创制及高附加值手性产物的绿色制备方面取得丰硕成果，相关研究成果已发表在ACS Catalysis (2024，2022)、Metabolic Engineering (2021)、Biotechnology for Biofuels (2021)、 Frontiers in Bioengineering and Biotechnology (2022)、ChemCatChem (2021)、Applied Microbiology and Biotechnology (2021)、 Bioresources and Bioprocessing (2022)等本领域权威期刊。
