近期，我校生物工程学院刘立明教授团队在原儿茶酸的微生物高效生产方面取得重要进展，研究成果“Efficient production of protocatechuic acid using systems engineering of Escherichia coli”正式发表于Metabolic Engineering (IF = 8.4) (https://doi.org/10.1016/j.ymben.2024.02.003)。
原儿茶酸（3,4-二羟基苯甲酸，PCA）是一个在植物中广泛存在的天然酚酸。研究表明，该化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒和抗肿瘤等生物学活性，也可作为材料单体用于合成高性能聚合物和食品包装材料，因此广泛应用于制药、保健食品、化妆品和新型材料行业。目前，PCA的生产主要还是依赖于效率低下的植物提取和容易造成环境污染的化学合成两种方法。在这种情况下，微生物发酵生产PCA代表了一种绿色、更有效、可持续的获得这种化合物的替代方案，因此越来越受到研究者的关注，具有广阔的市场前景。
刘立明教授团队针对大肠杆菌生产原儿茶酸过程中缺乏足量的前体供应、3-脱氢莽草酸脱水酶(AroZ) 活性被产物抑制以及产物对细胞的毒性问题，采用双重策略包括改造关键酶以缓解产物抑制和进化工程提高大肠杆菌对原儿茶酸的耐受性，以高效生产原儿茶酸。首先，在实验室前期工作中获得的一株高产莽草酸菌株基础上，阻断莽草酸的积累，使PCA的前体3-脱氢莽草酸 (DHS) 在5 L发酵罐中的积累量达到101.63 g/L。接下来通过体外酶催化和体内摇瓶发酵实验筛选得到高活性3-脱氢莽草酸脱水酶ApAroZ；进一步对ApAroZ进行蛋白质结晶，成功获得了ApAroZ的晶体结构；通过分子对接和MD模拟得到底物DHS-ApAroZ的催化构象，以此提出了ApAroZ催化DHS生成PCA的详细机制；接下来通过分子对接和MD模拟得到产物PCA-ApAroZ的闭合构象，对导致构象闭合的loop环上的氨基酸残基进行突变，并通过MD模拟计算突变体的RSMF，发现R363A突变体引起的蛋白构象变化最大，MD模拟和构象分析显示，突变体G365与N121之间的氢键距离由闭合构象的1.8Å提高到开放构象的3.5Å和7.0Å；R363A的动力学参数显示，与WT相比，kcat提高了2.07倍，抑制常数Kp从0.75 mM提高到1.21 mM，有效的缓解了产物抑制；使用突变体R363A的PCA03菌株可以生产37.02 g∙L-1的原儿茶酸。其次，通过转录组测序成功筛选响应PCA的启动子并成功构建了PCA响应生物传感器，将PCA03菌株在含逐渐增加PCA浓度的培养基中进化，经流式细胞仪分选和筛选，成功分离出进化菌株E. coli PCA05，菌株PCA05的死亡率显著降低，并且原儿茶酸的产量可以达到42.13 g∙L-1。最后，对发酵条件DO水平进行控制，PCA05菌株原儿茶酸的产量可以达到46.65 g∙L-1。本研究为原儿茶酸的生产提供了一种绿色、可持续的微生物合成方法。
图形摘要
刘立明教授为论文的通讯作者，我校2021级博士生王明为第一作者。上述研究得到了国家重点研发计划 (2020YFA0908500)、江苏省自然科学基金重大项目 (BK20220022) 和江苏省优秀青年基金 (BK20211529) 等资助。
近年来刘立明教授团队以合成生物学科学理论为指导，在(1)新一代工业生产菌株改造与创制；(2)新型生物催化剂设计与催化过程创建；(3)工业发酵过程优化与放大等方面取得丰硕成果，近3年相关研究成果已发表在Nature Communication (2022, 2024)、Angew (2022, 2023)、Chinese J C(2024)、Chemical E J(2023)、Metabolic Engineering (2023)等本领域权威期刊。
