近日，我校生物工程学院罗玮教授课题组在3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD）定向改造的研究方面取得重要进展，研究成果以“Cross-region combinatorial mutagenesis reveals context-dependent enhancement of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase catalytic efficiency”为题发表于International Journal of Biological Macromolecules（IF = 8.7）。
3α-HSD是类固醇代谢的核心氧化还原酶，在临床总胆汁酸检测、环境类固醇监测及甾体药物生物制造中具有重要应用价值。然而，现有商用酶制剂普遍存在催化活性低、热稳定性不足及生产成本高等瓶颈，严重制约了其工业化推广。如何精准提升该酶对雄酮等关键底物的催化效率并增强其操作稳定性，是该领域长期面临的重要挑战。针对上述问题，本研究运用蛋白质语言模型和蛋白质通道工程等多策略，构建了“人工智能辅助筛选+结构引导理性设计”的酶分子改造流程。团队首先以乙醇为助溶剂优化了雄酮底物的溶解与反应体系，为高通量筛选奠定了方法学基础；进而利用Caver通道分析锁定产物转运通道关键残基，并结合Saprot零样本突变效应预测，系统挖掘酶活提升突变位点。
研究发现，通道瓶颈残基K208A突变通过缩短产物释放路径、降低空间位阻，使催化效率提升至野生型的1.27倍；同时，研究揭示了显著的背景依赖性上位效应：当将正效突变N152F引入对雄酮催化效率大幅下降的负效骨架H1后，突变体酶活不仅得以恢复，反而提升至野生型的1.53倍。通过迭代组合优化，最终获得五联突变体的比活性达176.3 U/mg，kcat/Km为野生型的3.54倍。酶学表征表明，最优突变体的最适温度由30°C提升至35°C，最适pH由10.0提高至10.5；在45°C下处理1小时后仍保持近80%残余活性，热稳定性较野生型提升近3倍，碱耐受性亦显著增强，展现出优良的工业应用潜力。
血清总胆汁酸水平是评估肝功能的关键指标， 3α-HSD能催化胆汁酸中3α-碳位置的α-羟基团在氧化和还原形式之间的转换，被用作测量人血清总胆汁酸浓度的关键诊断酶，它通过与NAD+和NADH之间的相互转换耦合的反应进行。本研究获得的突变体被用来跟某商品化酶的比活性进行了对比，显示出显著优势（本研究突变酶的比活性为商品化的2倍），预计被用于工业化生产后将能显著降低人血清总胆汁酸检测用成本。本研究成果已经申请了专利保护。
我校生物工程学院罗玮教授为论文通讯作者，研究生王俊超为论文第一作者。近年来，我校生物工程学院罗玮教授团队利用合成生物学技术在高附加值产品代谢工程、酶/蛋白质工程以及发酵工艺方面取得重要进展，相关成果陆续发表于Biotechnology Advances（2025）、International Journal of Biological Macromolecules（2025、2024 a/b）、Journal of Agricultural and Food Chemistry（2026、2025 a/b/c、2024 a/b、2021）、Applied and Environmental Microbiology（2020a、2020b）、ACS synthetic Biology（2025a/b）、Bioresource Technology（2018）等本领域权威期刊。
图形摘要
